Направленная эволюция in situ — это имитация естественного отбора в лаборатории. Ученые вносят множество случайных мутаций в нужный ген, затем отбирают самые удачные варианты. Метод необходим для ускоренного создания белков и клеток с новыми свойствами (например, устойчивостью к болезням и токсинам).

В природе эти свойства появились бы сами только через миллионы лет или не появились бы вовсе. Метод очень актуален: почти одновременно было создано еще две системы, способные заменять сразу несколько нуклеотидов.

Авторы исследования, опубликованного в журнале Nature Communications, взяли за основу систему молекулярных ножниц CRISPR/Cas9, которая умеет перерезать ДНК в указанных местах. Этот метод хорош для выключения вредных генов или вставки целевой последовательности на место вырезанной. Однако для направленной эволюции необходимо не ломать ген, а менять его последовательность в максимально возможном количестве вариантов.

Ученые взяли белок Cas9n, который не режет обе цепи ДНК, как обычный Cas9, а лишь надрезает одну цепь. Прямо внутрь Cas9n вставили комплекс из нескольких ферментов — цитозиновой и адениновой деаминаз (они умеют портить цитозин и аденин) и ДНК-гликозилазы, которая удаляет из цепи испорченные основания. Для удаления гуанина ученые добавили в конструкцию измененную версию человеческой гликозилазы. Система получила название smACGmax.

Система работает так: на одной цепи ДНК образуется пустота вместо испорченных и удаленных оснований, а вторая цепь, по которой система репарации в норме восстанавливает первую, надрезается. В этой ситуации система ремонта оснований (BER) не может работать. Транслезионные полимеразы клетки вставляют на место удаленных аденина, цитозина или гуанина случайные основания.

Систему протестировали на клетках человека (HEK293T и HeLa). Ученые изменили ген HBEGF, кодирующий рецептор, который пропускает в клетку дифтерийный токсин. Редактор создал в культуре клеток тысячи случайных вариантов этого рецептора. В питательную среду добавили токсин, и выжили только те клетки, в которых рецептор случайно оказался невосприимчивым.

Авторы исследования отметили, что редактирование гуанина пока стабильно работает только при наличии рядом определенной последовательности нуклеотидов (мотива NGR), поэтому эффективность замены гуанина ниже, чем других оснований.

Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl + Enter.

Подписывайтесь на нас в Telegram, Яндекс.Новостях и VK